甘肃11选5app

技术服务

关注生之源微信 获取更多信息

血清胱抑素C测定的临床意义及方法学进展

日期:2011-08-08 00:00:00

摘要 在肾小球滤过功能试验中,血清肌酐、尿素及内生肌酐清除率是最常用的指标。由于以上指标尚存诸多不足,故人们一直在寻找新的反映肾小球滤过率变化的指标。胱抑素C是一种低分子量蛋白质,是半胱氨酸蛋白酶抑制物超家族的成员之一,可由机体所有有核细胞产生,产生率恒定。循环中的胱抑素C仅经肾小球滤过而被清除,是一种反映肾小球滤过率变化的理想的内源性标志物。血清胱抑素C浓度在作为肾功能试验时优于血清肌酐浓度。至于胱抑素C测定的方法学,已有快速、简便且可自动化的“颗粒加强免疫比浊法”的最新报道,使血清胱抑素C测定的广泛临床应用成为可能。
关键词:胱抑素C;肾功能试验;GFR;肌酐
胱抑素C(Cystatin c)是一种低分子量蛋白质,Grubb等首先报道其血清浓度与GFR密切相关,可作为肾小球滤过功能指标[1]。近年来有关胱抑素C测定的临床应用及方法报道日渐增多,本文就胱抑素C的结构与功能,作为反映肾小球滤过功能的内源性标志物及方法学进展作一综述。
1 胱抑素C的结构与功能
  胱抑素C,以前也被称为γ-微量蛋白及γ-后球蛋白,是一种低分子量、碱性非糖化蛋白质,分子量为13KDa,由120个氨基酸残基组成,是一种分泌性蛋白质。细胞先合成一个带信号肽的前体蛋白,编码胱抑素C的基因位于人类第20号染色体,大约为4.3Kb,包含3个外显子,基因上游45-50核苷酸处为“TATA盒样”序列(ATAAAA)。胱抑素C基因5′-侧翼区GC含量较高,转录起始位点上游400bp序列的G+C>70%,富含GC的“岛”也包括外显子1及内含子1、5′侧的一部分,整个富含GC“岛”约900bp,G+C含量为73%。此区域CpG/GpC比值接近于1,因此此区CpG是非甲基化的。在胱抑素C基因5′侧翼1Kb序列中发现了2个“GC盒”(GGGCGG),此区也发现了增强子核心样序列(GTGGAAGG)。由以上可见,胱抑素C基因5′侧翼序列与“看家基因”的启动子区具有相同的特性,即缺乏典型的“CAAT盒”、富含GC、有与转录因子Spl结合的“GC盒”。故可将胱抑素C基因看作是“看家基因”(house-keeping gene),即此基因在所有组织恒定持续地转录及表达。Northernx印迹也发现胱抑素C基因在所有的被观察的组织均表达,包括肾、肝、胰、肠、胃、肺及胎盘[2]
由于胱抑素C是一种分泌性蛋白质,故广泛地存在于各种体液中,如脑脊液、血液、唾液、精浆等。至于胱抑素C的确切生物学功能目前还了解不多,研究发现胱抑素C是半胱氨酸蛋白酶抑制物超家族的成员之一,是目前发现的对组织蛋白酶B抑制作用最强的抑制物,对木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、组织蛋白酶H及L也有抑制作用,故胱抑素C的一个生理学功能可能是调节半胱氨酸蛋白酶的活性。胱抑素C基因突变可导致遗传性胱抑素C淀粉样血管病(HCCAA),可发生脑动脉血管破裂,这是目前发现的直接与胱抑素C相关的临床疾病。
2 胱抑素C作为反映肾小球滤过功能的内源性标志物
  由于胱抑素C基因属“看家基因”,能在几乎所有的有核细胞表达,无组织学特异性,故机体胱抑素C产生率相当恒定。因胱抑素C是一种低分子量蛋白质,可经肾小球自由滤过,在近曲小管被重吸收并降解,肾脏是清除循环中胱抑素C的唯一器官,所以血清胱抑素C浓度主要由GFR决定,由此可见胱抑素C是一种理想的反映GFR变化的内源性标志物。
grubb及Simonsen等[1]首先研究了血中低分子量蛋白质(β2-微球蛋白、视黄醇结合蛋白、胱抑素C)浓度与GFR(51Cr-EDTA清除率)的相关性,发现血清胱抑素C、β2-微球蛋白及视黄醇结合蛋白浓度的倒数与GFR的相关系数γ分别为0.75、0.70及0.39,血清肌酐浓度倒数与GFR的相关系数γ为0.73。可见胱抑素C是低分子量蛋白质中与GFR最相关的内源性标志物,甚至优于血清肌酐。血清β2-微球蛋白浓度由于在炎症、肿瘤及免疫疾病时也可升高,故不是理想的GFR内源性标志物,视黄醇结合蛋白的代谢十分复杂,且部分与前白蛋白结合,不能自由经肾小球滤过,故血清视黄醇结合蛋白浓度的倒数与GFR相关性最差,不能作为GFR的内源性标志物。胱抑素C即使在炎症状态下,其产生率也不会改变,血清浓度受年龄、性别、疾病的病情变化的影响较小。Pergande等用99mTc-DTPA清除率作为肾小球滤过功能的“金标准”(<1.36ml/s为肾小球滤过功能受损,分析了胱抑素C、β2-微球蛋白及肌酐的血清浓度的诊断敏感性,结果发现它们诊断肾功能异常的敏感性分别为88.2%、64.7%及52.9%[34]。随后Newman报道[5]血清胱抑素C、肌酐浓度诊断异常GFR的敏感性分别为78.1%及57.1%,各自浓度倒数与GFR(51Cr-EDTA清除率)的相关系数分别为:0.81、0.50。Kyhse andersen[6]及Filley[7]的最近临床应用也表明血清胱抑素C浓度与GFR的相关性优于血清肌酐浓度。ROC(Receiver operating Characteristic)作图分析发现,通过改变“分割限”(cutoff limit)使胱抑素C的诊断敏感性下降至70%时,其诊断特异性仍可达75%;而通过改变血清肌酐浓度的“分割限”,使其诊断敏感性下降至50%时,才能获得100%的特异性,使敏感性增加至100%时,其特异性接近于零。各自ROC曲线下面积相差显著(P<0.001),说明胱抑素C的诊断准确性明显优于血清肌酐。
表1 各种测定方法比较

方法
检测限μg/L
CV%
测定时间
参考范围x±SD(范围),mg/L
分析样品数
RID
300
11
38h
1.3±0.26(0.72~1.7)
46
EIA
30
10 ~12
16h
1.1±0.42(0.63~2.5)
30
RIA
1.3
n.d.
16~21h
0.96±0.20(0.6~1.7)
100
FIA
1
n.d.
lor3h
n.d.
 
EIA
 
n.d.
4.5h
1.1±0.15
20
EIA
1.9
4~5
5h
0.75±0.65(≤20岁)
85
1.34±0.95(>20岁)
189
0.195
4~8
1.5h
1.25±0.22(0.86~1.7)
50
EIA
0.9
3~9
2h
1.78±0.26(女)
33
2.14±0.31(男)
33
PETIAm
150
2.0~3.2
7min
(0.61±1.21)
27
PETIA
27
3~5
5min
<1.25
 
PENIA
170
3~5
6min
(0.64~1.04)
30

3 血清胱抑素C测定的方法学
  由于血清中胱抑素C浓度较低,故其测定方法需较高的分析灵敏度及特异性。Lofberg等首先用单向免疫扩散法(RID)及酶免疫测定法(EIA)对胱抑素C含量进行测定,按照目前的标准,当时报道的这两种方法不仅费时,而且检测限也差(分别为300,30μg/L)。随后,又有较简单且更灵敏的放射、荧光及各种酶免疫测定(RIA、FIA及EIA)的方法报道,以改善胱抑素C测定的可靠性。 1993年Pergande等[3]报道了一种夹心酶免疫测定方法,其检测限虽然很低(0.9μg/L),但测定时间仍较长,无法常规应用,更无法用于急诊测定。以上各种测定方法均属非均相测定方法,很难自动化,因此限制了胱抑素C的广泛临床应用。胶乳免疫测定是一种均相测定方法,在胶乳颗粒上包被抗体,与抗原结合时颗粒发生凝集,此方法很容易自动化。Kabanda等于1994年报道的测定胱抑素C的胶乳颗粒凝集法是一种颗粒计数免疫测定法[8]。Kyhse andersen等[6]于同年报道了一种颗粒增强透射免疫比浊法(particle-enhanced turbidimetric immunoassay, PETIA),使胱抑素C测定的时间缩短至5min左右,且可在自动生化分析仪上进行,使胱抑素C测定的常规应用成为可能。随后,Newman等也报道了类似方法[9]。1997年,Finney等报道了一种能快速自动测定胱抑素C的颗粒增强散射免疫比浊法(particle-enhanced nephelometric immunoassay, PENIA),其测定结果与PETIA法相关性良好[10]。各种胱抑素C测定方法的比较见表1。
  从表1可见,单纯就检测灵敏度而言,RID法最差,而EIA、RIA及FIA法[1114]均优于PETIA及PENIA法。由于RIA法存在放射性污染,FIA法需昂贵的仪器,以及RIA、FIA、EIA法测定时间长,且不能全自动化,无法用于临床大批量标本的测定。PETIA及PENIA法虽然检测灵敏度差些,但仍可达150μg/L左右,远远低于健康人血清胱抑素C浓度的下限值,可满足临床需要;这两种测定方法基本上不受血红蛋白、胆红素、类风湿因子、甘油三酯的影响,回收率可达95%~109%,批内及批间变异系数均较小(<4.5%);加上这两种方法可全自动化,故在血清胱抑素C测定的常规临床应用中可首选PETIA或PENIA法。
各位研究者所报道的血清胱抑素C浓度的参考范围有一定的差异,这一方面是由测定方法不同所致,另一方面与所用胱抑素C标准品的来源不同有关,现应用的胱抑素C标准品有3种类型:①从人尿中纯化的胱抑素C;②纯化的人类胱抑素C,并用重组胱抑素C定值;③重组胱抑素C,并溶于马血清。Pergande等用一种尿蛋白标准品,发现血清胱抑素C浓度存在性别差异,其它研究者利用其它标准品时未发现性别差异。因此,应制定有关标准品制备的统一标准,以便进行方法比较及参考范围的建立。
4 小结
在肾脏疾病治疗中已涌现出许多新方法,如抗炎药物、肾移植及透析等。在应用这些方法的过程中,肾移植后排斥反应的监测及肾毒性药物肾毒性监测等。均需一种快速、简单且能准确地反映GFR变化的指标[15]。无论从理论上还是实践中,血清胱抑素C的测定均优于血清肌酐的测定,加上能自动化的检测的PETIA及PENIA方法的建立,已使胱抑素C的广泛临床应用成为可能。在今后的实践中,应注意测定方法的标准化问题;观察血清胱抑素C浓度在不同肾脏疾病状态下的变化规律;应在更大的人群内测定血清胱抑素C浓度,以分析是否存在年龄及性别相关的差异;从而最终确定胱抑素C的敏感性及特异性。
 
参考文献(省略)
 
转摘!
河北11选5APP 安徽11选5app 陕西快乐十分app 甘肃11选5app陕西快乐十分app下载 安徽11选5app 皇冠彩票开户 贵州11选5APP下载 必发彩票开户 甘肃11选5软件下载 必发彩票开户